 Новый метод ПЦР следующего поколения – цифровой капельный ПЦР (Droplet Digital PCR) - позволил группе ученых из Онкологического научного центра им. Фреда Хатчинсона создать уникальный протокол для обнаружения редких мутаций в митохондриальной ДНК (мтДНК) клеток человека.
Накопление мутаций в мтДНК связано с процессами старения, разными формами нервно-мышечных нарушений и онкологическими заболеваниями. Ранее их выявление было весьма затруднено вследствие недостаточной чувствительности методов. Проблема чувствительности состоит в том, что клетка содержит несколько сотен копий мтДНК. При этом вторичные мутации, накапливающиеся в течение жизни клетки, возникают лишь в единичных копиях, которые невозможно "увидеть" с помощью обычного ПЦР и секвенирования.
Для того чтобы преодолеть эти ограничения, исследователи из Онкологического научного центра им. Фреда Хатчинсона разработали новый протокол с высоким разрешением на основе метода ddPCR в реальном времени. Один из разработчиков, доктор Джейсон Белас, заявил, что без помощи их нового так называемого 3D-метода Digital Deletion Detection обнаружение редких делеций в составе мтДНК не представлялось бы возможным.
С использованием прибора QX100 для проведения цифрового капельного ПЦР доктор Белас и его сотрудники проанализировали восемь миллиардов человеческих геномов мтДНК мозга и обнаружили более 100000 геномов с делециями. Они также выяснили, что вопреки распространенному мнению о накоплении клеткой мутаций в процессе жизни за счет появления каждый раз новых, этот процесс, скорее, происходит в результате экспансии исходно возникших мутаций. Они предположили, что накопление уже существующих мутаций следует рассматривать в качестве основного фактора, способствующего возрастному накоплению делеций мтДНК.
Как работает 3D-анализ
3D-анализ представляет собой многоступенчатый протокол, включающий в себя рассеивание компонентов ПЦР-смеси на многие тысячи отдельных капель с попаданием их во множество отдельных микроячеек, в которых протекает ПЦР. Заключительный этап - это полногеномное секвенирование продуктов ПЦР из каждой отдельной ячейки. Новый прибор позволяет исследователям в реальном времени отслеживать результаты реакции индивидуально для каждой ячейки. А множество ПЦР, которые происходят одновременно внутри нескольких тысяч ячеек, позволяют редким мутациям "не затеряться" в общей смеси и быть накопленными в ходе индивидуальной реакции в достаточном количестве, необходимом для последующего анализа.
В результате анализа можно не только определить нужную мутацию мтДНК, но и посчитать с использованием количественного ПЦР абсолютное число мутированных геномов мтДНК в клетке.
Таким образом, 3D-анализ является важным новым инструментом, который позволит исследователям лучше изучить механизмы формирования и накопления делеций, а также их роль в старении.
Эта работа была опубликована в журнале Aging Cell.
Источник: http://www.innoros.ru/news/biologiya/13/12/novye-tekhnologii-pozvolyayut-glubzhe-razobratsya-v-protsessakh-stareniya | 
Это интересно! 
